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iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组学
技术原理
iTRAQ (Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation) 和TMT (Tandem Mass Tags) 技术是分别由美国AB Sciex公司和Thermo Fisher公司研发的多肽体外标记定量技术。iTRAQ和TMT原理类似, 以iTRAQ试剂为例,该试剂结构由报告基团、中性平衡基团和反应基团三部分组成。不同报告基团及其相对应平衡基团的质量和都相同, 而反应基团能与赖氨酸ε氨基和所有肽链的氨基末端连接, 可标记所有氨基酸。
不同标记试剂与来源于不同样品胰酶消化后的肽段结合,经过色谱分离, 并通过一级质谱和二级质谱。平衡基团在二级质谱时发生中性丢失, 而报告基团在二级质谱低质量区域产生多个报告离子,根据报告离子的峰面积计算同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值, 从而实现蛋白的相对定量。标记定量技术与目前主流的DIA(数据非依赖采集)定量技术是常用的定量方法,可以很好的应用到蛋白质组学定量分析实验中去。

 

iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组学技术原理图


iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组学实验流程图

iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组学数据分析流程图

技术特点
l  体外标记,适用于分析组织,细胞,血液等多种样品;
l  灵敏度高,可检测较低丰度蛋白;
l  通量高,可同时分析10个样品,适合大量临床样本;
l  可与富集磷酸化等修饰肽段的方法联用,更准确研究翻译后修饰变化。
 
样品要求
l  常规动物组织(脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤等):送样量>200mg;
l  常规植物组织(幼嫩的根、叶、花、愈伤组织等):送样量>1g;
l  悬浮/贴壁细胞:送样量>1x107个细胞或体积>50ul细胞沉淀;
l  血浆/血清样本:送样量>500ul;
l  微生物菌体:送样量湿重>100mg或体积>100ul。
 
注意事项
l  在蛋白质制备过程中使组织始终置于冰上,离心机、离心管等仪器设备要提前预冷,以防蛋白质的降解;
l  要加入适量的裂解液,裂解一定要充分、均匀;
l  植物和动物组织样本一般采用研磨或匀浆机破碎处理,细胞和菌体样本一般采用超声破碎,破碎过程中要避免材料的融化;
l  对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存(-80℃),对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备;
l  对于样本量需求少的研究,如果组织样品本身非常细小,可直接裂解,以减少蛋白质的损失。
 
项目报告
l  实验步骤
l  液相/质谱参数
l  质谱谱图
l  蛋白质的鉴定定量信息
l  生物信息分析
 
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