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lip-MS实验流程
1、蛋白质提取
该步骤需要2h+细胞培养时间。
(A)从面包酵母(S. cerevisiae)中提取蛋白质
(i) 将50ml酵母培养物在SD完全培养基中，30°C培养至OD600 ~0.7。在4℃下，3000g离心5分钟，收获培养物。
关键步骤：建议进行3个重复的实验。
(ii)用小勺或抹刀将沉淀转移到预冷的1.5ml研磨管中。确保充注量小于20%;如有必要，将沉淀分成几管，每管添加3个锆珠。
(iii)加入天然生裂解缓冲液500µl。
(iv) 使用6m/s的细胞破坏装置，在4°C下打珠，研磨细胞30s，暂停4分钟，重复打珠三次。放置样品在冰上2min，以防止样品过热（预冷研磨管和均质仪）。
(v) 4°C, 16000g离心10分钟，清除细胞碎片。将上清液转移到新管中，重复此离心步骤。将上清液转移到新管中。
(vi)使用BCA测定法测量蛋白质浓度，并用天然裂解缓冲液将蛋白质提取物稀释至1mg/ml（根据试剂浓度适量调整）。
(B)从细菌（大肠杆菌）中提取蛋白
(i)在37°C的M9培养基中培养，如OD600~0.8。在4°C下，3000g离心5 min。
关键步骤：我们建议重复进行三次实验。
(ii)继续执行如上所述的步骤1A（ii-vi）。
(C)从哺乳动物细胞系中提取蛋白
(i) 从1×107HeLa细胞开始。
(ii) 用0.5ml 10mM（或1×）PBS清洗细胞两次，加入PBS后用吸头轻轻吹打，1000g,离心5min后小心弃去PBS。
(iii) 将细胞重新悬浮在尽可能少的10mM PBS中(如200µl)，并将细胞悬液转移到冷却的研磨管（每管3个锆珠）中。
(iv) 使用6m/s的细胞破坏装置，在4°C下打珠，研磨细胞30s，暂停4分钟，重复打珠三次。放置样品在冰上2min，以防止样品过热（预冷研磨管和均质仪）。
(v)1000g离心5min，去除细胞碎片，将上清液转移到新试管中。
(vi) 使用BCA测定法测定蛋白质浓度，并用10mM（或1×）PBS将蛋白质提取物稀释至1mg/ml。
(D) 从生物液体中提取蛋白质
(i) 从30-50µl的生物液体开始。
(ii)（可选）使用试剂盒（如前2个丰富的蛋白质消耗旋转柱）去除高生物液体中的丰度蛋白（如血浆中的白蛋白和免疫球蛋白）。编号：85161)或前12个丰富的蛋白质消耗旋转柱。
(iii) 使用BCA测定法测量蛋白质浓度。添加10%（vol/vol）10×天然裂解缓冲液（参见试剂设置）。不要稀释至总蛋白少于1 mg/ml。
注意事项：
在添加LiP蛋白酶前的提取步骤应尽快进行，并在冰上进行，提前打开制冰机。
2、LiP与PK（蛋白酶K）
该步骤需要25min。
取100ug样本用PK进行LiP。另取100ug剩下的样本将只用胰蛋白酶消化（见步骤9及以下），并将作为一个内部控制。其余样品分装每管100ug（根据实际蛋白量）,液氮速冻后，-20度冰箱保存。
(1) 每个样品取100µg的蛋白质提取物。
(2) 将样品放入金属浴中加热5min，使样品温度达到 25 °C。（加热模块提前半小时打开）
(3) 以 1:100 的酶/底物比 (wt/wt) 将 PK 添加到蛋白质提取物中。（直接在金属浴上加样，缠封口膜）
(4) 在 25°C 下将样品孵育1分钟。 孵育步骤精确计时。
(5) 将样品迅速转移到沸水中5分钟以灭活PK。（沸水提前一小时准备）
关键步骤：确保水浴温度>95°C，以确保PK完全失活。整个容器的持续加热对于正确淬火很重要。
(6)从水浴中取出管子，让它们在室温的金属模块中冷却5分钟。加入10% (wt/vol) DOC（脱氧胆酸钠） 溶液至终浓度5% (wt/vol) 。
注意事项：首先，酶必须保持低温，使用后应丢弃酶的等分物；其次，必须精确控制与非特异性蛋白酶的孵育时间。蛋白酶的猝灭是一个关键的步骤，因为立即和完全失活的蛋白酶是必要的，以最大限度地提高蛋白水解模式的重现性。
3、连续 LysC–胰蛋白酶消化
该步骤处理时间为 6 小时，然后过夜消化。
(1) 通过将DTT添加到12 mM的最终浓度来减少半胱氨酸残留，然后在37°C下将管孵育30 分钟。
(2) 通过将IAA添加到40 mM 的最终浓度来减少烷基化的半胱氨酸残基。室温下在黑暗中孵育 45分钟（IAA 对光敏感）。（对照样品一起做还原烷基化）
(3) 将一滴样品放在pH指示纸上，确保pH值为7.5–8.5。如果 pH值太低，则通过添加 100 mM 碳酸氢铵将 pH值调节至 ~8。
(4) 添加 LysC 到 1:100的酶/底物比 (wt/wt) 体系中。 在800rpm 转速下，37°C （提前半小时预热）下孵育4 小时。
(5) 通过添加4倍体积的100 mM 碳酸氢铵，将样品稀释至 1%（重量/体积）DOC（对照样品一起稀释后做酶解）。
(6) 将胰蛋白酶添加到1:100 的酶/底物比 (wt/wt) 体系中。 在 800rpm 的转速下，在 37°C 下孵育过夜。
(7) 停止消化，加入98%（vol/vol）甲酸至最终浓度为2%（vol/vol）沉淀DOC。验证样品的最终pH为<3。
(8) DOC酸化后形成白色沉淀。为了去除沉淀物，将样品在室温下以16000g离心10min，小心地将澄清上清液转移到一个新的微离心管中，并重复此离心步骤。
临界步骤 在转移上清液时，不要干扰DOC颗粒，因为DOC可能会干扰质谱测量。
暂停点 样本可以在−20℃中存储至少6个月。
4、多肽脱盐
该步骤需要2~3h。
(1) 使用Sep-Pak柱包装10mg C18树脂来去除样品。根据推荐使用脱盐缓冲液A（洗涤）和B（洗脱），加载、洗涤和洗脱肽混合物。例如，洗脱体积可以为2×400µl。（直接用现在用的脱盐方法即可）
(2) 用45°C的真空离心机蒸干多肽溶液。
(3) 将多肽在0.1%(vol/vol)甲酸中重溶至最终浓度为~1mg/ml。根据步骤1(vi)中BCA测定的蛋白质浓度(以及选项B-D中相应的步骤)，估计添加的体积，假设在样品制备过程中没有蛋白质或肽的损失。将样品转移到质谱小瓶中进行后续的质谱分析（注意上质谱时电荷数选择1-7）。
暂停点：样本可以在−20°C中存储至少6个月。
数据分析流程
1、蛋白质及多肽的定量分析
(1) 将胰酶处理的对照样品质谱数据导入Proteome Discoverer进行分析，使用搜索引擎工具对谱图进行数据库搜索，获得每个样品的蛋白质丰度定量信息。
使用参数设置如下：
母体和片段质量容差为10 ppm，
胰蛋白酶（全酶切），
酶的最大漏切位点为2，
半胱氨酸氨基甲基化 (carbamidomethylation on cysteines) 作为固定修饰，
蛋氨酸氧化 (oxidation of methionines) 作为可变修饰。
(2) 将LiP-MS处理样品的质谱数据导入Proteome Discoverer进行分析，使用搜索引擎工具对谱图进行数据库搜索，获得每个样品的多肽丰度定量信息。
使用参数设置如下：
母体和片段质量容差为10 ppm，
胰蛋白酶（半酶切），
酶的最大漏切位点为2，
半胱氨酸氨基甲基化 (carbamidomethylation on cysteines) 作为固定修饰，
蛋氨酸氧化 (oxidation of methionines) 作为可变修饰。
(3) 根据(1)计算组间蛋白质的丰度倍数变化FC及pvalue。
(4) 根据(2)计算组间多肽的丰度倍数变化FC及pvalue。
(5) 根据蛋白质ID将(3)和(4)数据进行整合。
(6) 将LiP-MS多肽丰度变化做归一化处理。具体计算方法：将组间多肽丰度变化倍数除以对应蛋白质的丰度变化倍数。对于丰度未显著发生改变的蛋白质，使用1作为其丰度变化倍数。
2、筛选差异多肽
(1) 通过log2FC和pvalue筛选差异多肽。建议使用|log2FC|>1和p<0.01作为阈值。LiP-MS样品中丰度显著发生变化的多肽，被认为位于结构发生变化的蛋白质特定区域。
(2) 以火山图的形式展示多肽丰度的变化倍数与相关pvalue的关系。
3、目标多肽构象的可视化
(1) 确定目标多肽及相应蛋白质在PDB数据库中的ID；
(2) 使用Cn3D工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml)将目标多肽匹配到蛋白质的3D结构上，查看其构象变化。
(i) 打开Cn3D网页，从File菜单导入目标蛋白质的PDB数据库ID；
(ii) 进入View菜单查看蛋白质的3D结构；
(iii) 输入目标多肽序列查看其在蛋白质中的位置，并根据需要选择合适的类型、颜色加以展示。
4、分析注意事项
(1) 设置LiP-MS样品的对照数据；
(2) 每组样品至少包含2个以上的平行数据；
(3) 不同处理组数据的搜库参数设置；
(4) 多肽数据归一化处理；
(5) 进行差异多肽筛选时阈值的调整；
(6) 目标多肽在蛋白质三维构象中的可视化。
参考文献
1. S. Schopper et al., Measuring protein structural changes on a proteome-wide scale using limited proteolysis-coupled mass spectrometry. Nature Protocols 12, 2391-2410 (2017).
2. V. Cappelletti, T. Hauser, I. Piazza, M. Pepelnjak, P. Picotti, Dynamic 3D proteomes reveal protein functional alterations at high resolution in situ ll Dynamic 3D proteomes reveal protein functional alterations at high resolution in situ. Cell, 1-15 (2021).
3. Y. Feng et al., LiP-Quant, an automated chemoproteomic approach to identify drug targets in complex proteomes - ScienceDirect. European Journal of Cancer 138, (2020).
4. H. Meng et al., Discovery of a cooperative mode of inhibiting RIPK1 kinase. Cell Discov 7, 41 (2021).
